Корреляция ферментных и биологических индикаторов при обеззараживании перекисью водорода

Авторы: Нил П. Маклеод, Мелани Клиффорд и Джей Марк Саттон. Public Health England, Национальная служба инфекций, Портон-Даун, Солсбери, Великобритания.

Аннотация

Споры Geobacillus stearothermophilus на дисках из нержавеющей стали обычно применяют как биологические индикаторы (BI) при валидации обеззараживания перекисью водорода. Из-за вариабельности BI и длительного ожидания результата авторы исследовали ферментный метод оценки процесса.

Термостабильную аденилаткиназу наносили на твёрдый носитель и вместе с коммерческими BI, содержащими 10⁶ спор, подвергали воздействию парофазной перекиси водорода (VPHP) в гибкоплёночном изоляторе. BI количественно оценивали в разные моменты времени, а результат сопоставляли с остаточной активностью tAK, измеренной по образованию АТФ.

Оба типа индикаторов показали двухфазный профиль инактивации. Между циклами наблюдались различия: в отдельных опытах BI достигали предела обнаружения через шесть минут, тогда как в других сохраняли жизнеспособность более 12 минут.

Профили инактивации фермента и спор оказались сходными, что позволило связать относительные световые единицы (RLU) tAK с логарифмическим снижением BI. Результат tAK получают через несколько минут после цикла, тогда как подтверждение отсутствия роста BI занимает до семи суток.

Практическое значение

В фармацевтическом производстве чистые помещения и изоляторы регулярно обеззараживают для контроля микробной нагрузки. Один из методов — перевод водного раствора перекиси водорода в пар или аэрозоль с последующим распределением по обрабатываемой среде.

BI представляют собой стальной купон с популяцией устойчивых бактериальных спор. После цикла их инкубируют, чтобы установить наличие или отсутствие роста. Семидневное ожидание увеличивает продолжительность и стоимость разработки и подтверждения цикла.

Ферментный индикатор позволяет за несколько минут прогнозировать, достигнута ли требуемая инактивация BI, и потому может ускорить разработку и повторную квалификацию циклов.

Введение

Перекись водорода действует как окислитель, повреждая белки, липиды и ДНК, и эффективна против широкого спектра микроорганизмов, включая бактериальные споры. В данном исследовании использовали влажную конденсационную систему VPHP.

Параметры цикла устанавливают отдельно для каждого помещения или изолятора с учётом объёма, площади и материала поверхностей, а также размещённого оборудования.

Стандартные BI содержат споры G. stearothermophilus на небольших стальных дисках в пакетах Tyvek. Обычно на диск наносят 10⁶ спор и характеризуют его D-значением — временем или дозой, необходимыми для снижения популяции на 90% в заданных условиях.

Оценка BI требует микробиологической лаборатории, инкубатора при 55–60 °C и обученного персонала. Количественный подсчёт трудоёмок, а показатели внутри партии и между партиями заметно варьируют, поэтому BI применяют главным образом при разработке, валидации и повторной квалификации, но не для каждого рутинного цикла.

В повседневном мониторинге обычно используют параметрический выпуск по концентрации перекиси водорода, температуре и относительной влажности. tAK может дополнить эти параметры прямым количественным показателем воздействия процесса.

Фермент tAK первоначально выделен из термофильной археи Sulfolobus acidocaldarius и устойчивее обычных ферментов к нагреванию и окислению. Его остаточную активность определяют по АТФ, образующемуся в реакции, с помощью люциферин-люциферазного биолюминесцентного анализа.

Материалы и методы

В качестве BI использовали диски из нержавеющей стали диаметром 9 мм с нагрузкой более 1 × 10⁶ спор G. stearothermophilus в пакетах Tyvek. Рекомбинантную tAK S. acidocaldarius распыляли тонкой плёнкой на полиэфирную ленту, которую разрезали на полоски 5 × 50 мм и устанавливали в полипропиленовые держатели.

Обеззараживание проводили коммерческой системой, распылявшей перекись водорода со скоростью 20 мл/мин в гибкоплёночном изоляторе объёмом 1,01 м³. После образования видимого тумана аэрозоль испарялся, а перекись конденсировалась на поверхностях.

В каждой временной точке рядом размещали три BI и четыре tAK-индикатора. Генератор в течение трёх минут подавал 33%-ный раствор перекиси водорода. Индикаторы извлекали через 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 минут; одновременно регистрировали концентрацию перекиси, относительную влажность и температуру.

Опыт повторили в шести независимых циклах. После каждого цикла изолятор вентилировали до концентрации перекиси менее 1 ppm. Чтобы остановить дальнейшую инактивацию без вскрытия изолятора, индикаторы в заданный момент погружали в соответствующий реагент.

Споры снимали с купонов ультразвуковой обработкой и перемешиванием, последовательно разводили, высевали на триптиказо-соевый агар и инкубировали 48 часов при 55,4–56,3 °C. Активность tAK измеряли на люминометре после добавления реагентов ATP-SL и ADP; использовали положительные и отрицательные контроли.

Для BI рассчитывали среднее число КОЕ, а для tAK — среднее RLU. Вариабельность выражали коэффициентом вариации и 95%-ным доверительным интервалом. Логарифмическое снижение BI определяли относительно значения после газирования в нулевой момент.

Связь RLU tAK с логарифмическим снижением BI описывали четырёхпараметрической логистической кривой. Дополнительно моделировали BI с различной устойчивостью к перекиси водорода.

Результаты

Во всех шести циклах остаточная активность tAK последовательно снижалась. Сигнал сохранялся выше нижнего предела обнаружения даже после дозы, соответствующей более чем шестилогарифмической инактивации применённых BI.

Коммерческие BI, обработанные в тех же циклах, проявили значительную вариабельность. В некоторых циклах число жизнеспособных спор падало ниже предела обнаружения (<5 КОЕ) за шесть минут, в других полная инактивация не достигалась и через 12 минут. Среднее время достижения номинального снижения на шесть порядков составляло 10 минут при стандартном отклонении 2,5 минуты.

У tAK и BI наблюдалась двухфазная кинетика: начальная почти линейная фаза сменялась более медленным нелинейным участком. Двухфазная модель описывала данные лучше единой линейной зависимости.

Сопоставление средних данных шести циклов показало сильную корреляцию активности tAK с инактивацией BI. Однако доверительный интервал прогнозируемого снижения расширялся при малых значениях RLU и высоком ожидаемом уровне инактивации.

Обсуждение

Замедление инактивации остаточной популяции, или «хвост», может быть связано как с параметрами VPHP-процесса и свойствами поверхностей, так и с неоднородным нанесением 10⁶ спор на небольшой диск. Перекрывающиеся или инкапсулированные споры защищены от перекиси, глубина проникновения которой меньше, чем у некоторых других стерилизующих факторов.

Средний коэффициент вариации между повторными tAK-индикаторами в одной временной точке составлял 19% против 96% для BI; между циклами — 26% против 179% соответственно. Вариабельность складывается из различий самого процесса, индикаторов и метода количественного подсчёта.

Заявленное D-значение BI составляло одну минуту в стандартном резистометре при 2 мг/л газообразной перекиси, однако в исследуемой системе снижение на шесть порядков занимало до 12 минут. Поэтому соотношение tAK и BI следует калибровать для конкретного типа индикатора и процесса.

Моделирование показало, что калибровочную зависимость можно адаптировать к BI, инактивирующимся вдвое быстрее, с сопоставимой скоростью или вдвое медленнее, а также к системам, создающим другую поверхностную концентрацию перекиси.

Выводы

tAK-индикаторы дают количественную информацию об эффективности процесса сразу после завершения цикла. Это может существенно ускорить разработку, оптимизацию, валидацию и повторную квалификацию VPHP-процессов.

Для подтверждения универсальности зависимости необходимы исследования других коммерческих систем, включая установки с иными механизмами подачи и сухие процессы перекиси водорода.

Финансирование и конфликт интересов

Работу финансировала Protak Scientific Ltd. Технология tAK изобретена в Public Health England, которая получает лицензионные платежи при её коммерциализации; спонсор не участвовал в планировании исследования и интерпретации данных.

Литература

1. Mau T., Hartmann V., Burmeister J., Langguth P., Hausler H. Development of a sterilization-in-place application for a filling machine using vaporized hydrogen peroxide. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 2004;58(3):130–146.

2. Barbut F., Menuet D., Verachten M., Girou E. Comparison of a hydrogen peroxide dry-mist disinfection system and sodium hypochlorite for eradication of Clostridium difficile spores. Infection Control and Hospital Epidemiology. 2009;30(6):507–514.

3. Horn K., Otter J. Hydrogen peroxide vapor disinfection and hand-hygiene improvements reduce healthcare-associated infections. American Journal of Infection Control. 2015;43(12):1354–1356.

4. Otter J. A., French G. L. Survival of nosocomial bacteria and spores on surfaces and inactivation by hydrogen peroxide vapor. Journal of Clinical Microbiology. 2009;47(1):205–207.

5. Zonta W., Mauroy A., Farnir F., Thiry E. Viricidal efficacy of hydrogen peroxide nebulization against murine norovirus and feline calicivirus. Food and Environmental Virology. 2016.

6. Sandle T. Sterility, Sterilization and Sterility Assurance for Pharmaceuticals. Woodhead Publishing; 2013:129–141.

7. Coles T. Hydrogen peroxide sanitization, part 1: Demystifying the process. Clean Air and Containment Review. 2012;(9).

8. Watling D. P. M. The relationship between saturated hydrogen peroxide, water vapor and temperature. Pharmaceutical Technology Europe. 2004;16:50–54.

9. La Duc M. T., Kern R., Venkateswaran K. Microbial monitoring of spacecraft and associated environments. Microbial Ecology. 2004;47:150–158.

10. ISO 11138-1:2006. Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 1: General requirements.

11. Coles T. Hydrogen peroxide sanitization, part 2: Demystifying gassing-cycle development. Clean Air and Containment Review. 2012;(10).

12. Agalloco J. P., Akers J. E. Overcoming limitations of vaporized hydrogen peroxide. Pharmaceutical Technology. 2013;37(9).

13. Nugent P. G. et al. Application of rapid-read cleaning indicators to improve process control in hospital sterile-services departments. Journal of Hospital Infection. 2013;84:59–65.

14. Hesp J. R. et al. Thermostable adenylate kinase technology: a new process indicator and validation tool for reprocessing surgical instruments. Journal of Hospital Infection. 2010;74(2):137–143.

15. Ungurs M. et al. Quantitative measurement of protein-removal efficiency by a cleaning formulation. Journal of Hospital Infection. 2010;74:144–151.

16. Chen L. et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. Journal of Bacteriology. 2005;187(14):4992–4999.

17. Pottage T., Macken S., Walker J. T., Bennett A. M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus is more resistant to vaporized hydrogen peroxide than commercial Geobacillus stearothermophilus biological indicators. Journal of Hospital Infection. 2012;80(1):41–45.

18. Shintani H. Important points to achieve reproducible sterility assurance. Biochemistry & Physiology. 2014;3:135.

19. ISO 18472:2006. Sterilization of health care products — Biological and chemical indicators — Test equipment.