Закрытые изоляторы для аутологичной клеточной терапии

Этапы аутологичной CAR-T-терапии

Сначала у пациента методом афереза отбирают Т-клетки: кровь выводят из организма, отделяют нужные компоненты, а оставшуюся кровь возвращают пациенту. Затем Т-клетки направляют в лабораторию или на производственную площадку, где в них вводят ДНК, обеспечивающую экспрессию химерных антигенных рецепторов (CAR). Эти рецепторы позволяют Т-клеткам распознавать целевой антиген на опухолевых клетках.

Генетически модифицированные CAR-T-клетки размножают в лаборатории; этот этап занимает примерно 3–4 недели. После получения достаточного количества клетки замораживают и отправляют в лечебное учреждение. Перед инфузией пациенту часто проводят короткий курс химиотерапии для лимфодеплеции — уменьшения числа собственных Т-клеток и освобождения места для CAR-T-клеток. Препарат вводят внутривенно или через центральный венозный катетер менее чем за 30 минут. После введения CAR-T-клетки размножаются и уничтожают клетки, несущие целевой антиген.

Требования к производственной среде

Все манипуляции до заключительной инфузии должны выполняться в соответствии с действующими правилами надлежащей производственной практики (cGMP) США и Европы. Для асептического биофармацевтического процесса возможны два основных варианта: зона класса A на фоне класса B либо изолятор, размещённый, согласно пересмотренному Приложению 1 GMP ЕС, в помещении класса C или D. Классы A–D определяют требования к вентиляции, фильтрации, скорости и кратности воздухообмена, а также к одежде персонала.

Изолятор в помещении класса C или D улучшает условия труда и обеспечивает полное разделение оператора, процесса и окружающей среды. Автор отмечает распространённую схему с чистым помещением класса C и окружающей зоной класса D. Интегрированный изолятор для клеточной терапии со шлюзом, инкубатором и центрифугой был представлен ещё в 2016 году и подходит как для исследований и разработок, так и для последующего рутинного производства.

Индивидуальные одноразовые мини-изоляторы

При одновременном ведении нескольких процессов клеточной терапии каждый протокол должен оставаться автономным и отделённым от остальных. Одно из решений — индивидуальный гибкий мини-изолятор для каждого пациента, аналогичный системам, применявшимся во французском INRA при исследовании микробиома моноксенных и безмикробных мышей.

Для сохранения индивидуальности процесса предлагаются стерильные закрытые изоляторы, поставляемые готовыми к применению и стерилизованные гамма-излучением. Закрытые изоляторы используются с конца 1940-х годов — сначала в стерильной хирургии, затем при разведении безмикробных лабораторных животных.

Все изделия и материалы, вводимые в зоны класса C или D, маркируют штрихкодом или равноценным способом, стерилизуют и упаковывают в два слоя. После удаления внешней упаковки их проводят через шлюз биодеконтаминации H₂O₂.

Конструкция и параметры CIPCI®

Замороженные при −70 °C клетки вводят в чистое помещение класса C через систему быстрого переноса Alpha/Beta RTP, совместимую с входным портом индивидуального закрытого технологического изолятора CIPCI® (Cell Individual Process Closed Isolator).

CIPCI® — прозрачный гибкий одноразовый стерильный мини-изолятор положительного давления объёмом приблизительно 150–250 л. Он оснащён перчаточными портами для работы предплечьями и дверью Beta RTP диаметром 190 мм, которая соединяется с дверью Alpha для переноса клеток, а также с изоляторами хранения и обслуживания. Вентиляционно-фильтровальная система включает входной гидрофобный мембранный фильтр 0,5 мкм и выходной HEPA-фильтр. Для надувания используют сжатый воздух либо смесь газов, например с добавлением CO₂ для культивирования клеток. Рабочее избыточное давление составляет 30–50 Па.

Системы Alpha/Beta RTP позволяют многократно загружать и выгружать материалы без перекрёстной контаминации жизнеспособными и нежизнеспособными частицами. Поставщики контролируют качество прокладок и безопасность многократных соединений. В каждом CIPCI® предусмотрены бесполые соединители CPC для стерильного переноса жидкостей на всём пути от лейкафереза до инфузии. Прозрачное окно в верхней части позволяет пользоваться расположенными снаружи микроскопом или камерой; изображение с камеры может применяться для сортировки клеток средствами искусственного интеллекта.

Главный принцип установки — применение только закрытых изоляторных систем от лейкафереза до инфузии, включая микроскопию. Материалы передают во вспомогательное оборудование через асептические соединения, не открывая систему в окружающую среду. Герметичность на всём протяжении операций защищает процесс от внешней и перекрёстной контаминации.

Перенос, оттаивание, центрифугирование и инкубация

Клетки передают непосредственно в CIPCI® из-за пределов чистого помещения через систему MW RTP. Для замороженных при −70 °C клеток предусмотрен рукав, который на необходимое время погружают во внешнюю водяную баню с водой для инъекций (WFI).

Стерильные готовые к применению контейнеры MW RTP одновременно служат роторами центрифуги. Благодаря этому можно использовать серийную охлаждаемую или неохлаждаемую центрифугу без интеграции и доработки. В зависимости от технологического маршрута инкубацию проводят при 35 °C в инкубационном помещении, входящем в чистую зону, либо помещают контейнер MW RTP в подходящий инкубатор.

Компьютеризированная система обеспечения целостности данных охватывает хранение и весь процесс. Заданные протоколы и перечни компонентов позволяют прослеживать движение клеток и материалов и в любой момент точно определять стадию обработки каждой индивидуальной партии.

Изоляторы хранения и обслуживания оснащены однонаправленным воздушным потоком и HEPA-фильтрацией для максимально быстрого удаления следов H₂O₂ во время аэрации после биодеконтаминации. Остаточную концентрацию H₂O₂ измеряют анализатором Picarro®; допустимый остаточный уровень входит в число валидируемых параметров процесса. Изолятор хранения поддерживает стерильность компонентов, а сервисные изоляторы передают их в выбранный CIPCI® через вертикальные порты MW RTP для чаш центрифуги и горизонтальные порты для остальных компонентов.

Комплексная установка получила название ELECT® — Extensive Linked Enclosures for Cell Therapy, то есть «комплекс взаимосвязанных изоляторов для клеточной терапии». Размещение по принципу ballroom обеспечивает удобство персонала и высокую безопасность пациента при умеренных капитальных и эксплуатационных затратах.

Заключение

Объединение изоляторной технологии, микрофильтрации, HEPA-фильтрации, биодеконтаминации парами H₂O₂, систем RTP, соединителей CPC и гамма-стерилизованных одноразовых компонентов позволяет выполнять требования пересмотренного Приложения 1 GMP. Такой комплекс поддерживает строго индивидуальные протоколы аутологичной CAR-T-терапии, в том числе при лечении солидных опухолей, в заданные сроки и при контролируемых затратах.

Литература

1. Swanson D. L. Flexible facility design for multiple cell therapy processes. Pharmaceutical Engineering. 2020.

2. US Food and Drug Administration. Approved cellular and gene therapy products. 2019.

3. European Medicines Agency. Advanced therapy medicinal products: overview. 2020.

4. Points to consider for the aseptic processing of sterile pharmaceutical products in isolators. Parenteral Drug Association, 2020; FDA Guidance for Industry: Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice, 2004; EudraLex, Volume 4, Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products, European Commission, 2008.

5. SANYO. Integrated Cell Processing Work Station CPWS PPLF-4205. 2013.

6. United States Patent Office No. 2473033. Sterilized and air-conditioned chamber for surgical uses.

7. Thorogood D. A history of isolator and containment technology. Part 1: Early containment leading to flexible film isolators. Clean Air and Containment Review. 2014;18:14–17.

8. Fadda M., Cesarini M. Addressing key issues in successful implementation of commercial-scale cell therapies: a real case study. ISPE Europe Biotechnology Conference, 25–26 September 2019, Brussels.

9. Boukami M. Minimizing contamination risk in single-use final filtration and filling. 17 September 2020, Molsheim, France.

10. AFI/JCE Biotechnology. KATRINA AFI centrifuge, Château-Gontier, France.